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全国狂犬病监视检测方案

出处:卫生部 浏览次数: 1次 发布时间:2007-12-21 11:25:54
全国狂犬病监视检测方案(试行)
   一、概述
    狂犬病是由狂犬病病毒引起的一种人兽共患传染病,按《中华人民共和国传染病防治法》的限定为乙类传染病。许多种类的哺乳动物都与狂犬病的传播有关,犬是发扬中国家人狂犬病最首要的储存宿主和传播宿主。人感染狂犬病最常见的方式是经过感染狂犬病毒的犬、猫、野生食肉动物以及食虫和吸血蝙蝠的咬伤、挠抓、舔舐皮肤或粘膜破损处而感染。狂犬病毒首要经过破损的皮肤或粘膜侵入人体,经神经末梢上行加入中枢神经系统,临床表现首要为急性、实行性、几乎不可逆转的脑脊髓炎,病死率100%。
    狂犬病在世界范围内广泛分布。据1999年世界狂犬病调查报告,145个国家和地区中仅有45个无狂犬病报告。近年来,我国狂犬病疫情一直呈上升趋势,病死数居我国37种法定报告传染病首位。1996年全国报告狂犬病发病数曾一度较低,为159例,而2004年全国狂犬病报告发病数上升至2660例,与2003年同期相比上升30.58%。2004年狂犬病死亡人数占我国法定报告传染病总死亡构成的35.72%。我国的广西、湖南、江苏、安徽、湖北、广东和贵州等省份近年来疫情持续上升,疫情形势十分严峻。因此,建立全国狂犬病监视检测系统,在狂犬病多发地区展开监视检测,剖析狂犬病流行因素、把握狂犬病的疫情特点与流行趋势,对于狂犬病的预防和控制具有重要的意义。
二、监视检测目的
(一)把握我国狂犬病的疫情动态和流行规律,剖析流行因素,为制定有用的预防控制办法提供科学依据。
(二)了解狂犬病暴露后预防处置现状,评价预防处置效果,为进一步标准暴露后预防处置提供依据。
三、监视检测定义
(一)病例定义
按照流行病学史、临床症状和实验室检测结果三项指标确定病例的定义。
1、流行病学史
有被犬、猫或其他宿主动物舔、咬史。
2、临床症状
(1)愈合的咬伤伤口或周围感觉异常、麻木发痒、刺痛或蚁走感。出现兴奋、烦躁、恐惧,对外界刺激如风、水、光、声等异常敏感。
(2)“恐水”症状,伴交感神经兴奋性亢进(流涎、多汗、心律快、血压增高),继而肌肉瘫痪或颅神经瘫痪(失音、失语、心律不齐)。
3、实验室检测
(1)免疫荧光抗体法检测抗原:发病第一周内取唾液、鼻咽洗液或脑脊液涂片、角膜印片、皮肤切片,用抗狂犬病荧光抗体染色,狂犬病病毒抗原阳性。
(2)RT-PCR方法检测病毒核酸:发病第一周内取唾液、鼻咽洗液、脑脊液、角膜或皮肤组合,用RT-PCR方法检测狂犬病毒核酸阳性。
(3)死后脑组合标本分离病毒阳性或印片荧光抗体染色阳性、脑组合内检到内基氏小体或RT-PCR方法检测脑组合标本中病毒核酸阳性。
4、病例分类
(1)狂犬病疑似病例:指各级医疗单位临床医生上报的具有狂犬病临床表现,而难以确诊为狂犬病的病例。
(2)临床诊断病例:流行病学史加上临床表现的任意一条。
(3)确诊病例:临床诊断病例加上实验室检测的任意一条。
(二)狂犬病暴露者定义
狂犬病暴露者指被狂犬、疑似狂犬或狂犬病宿主动物抓伤、咬伤、舔舐皮肤或粘膜破损处的所有人员。
四、监视检测内涵
(一)全国常规监视检测
1.    病例的发现与报告
按照《中华人民共和国传染病防治法》和《传染病疫情报告办理标准》,各级各类医疗机构、疾病预防控制机构和卫生检疫机构实行职务的医务人员发现疑似、临床诊断或实验室确诊病例应在诊断后24小时内填写报告卡实行网络直报。不具备网络直报条件的应在诊断后24小时内向相符合单位送(寄)出传染病报告卡,县级betway体育手机版(以下简称疾控中心)和具备条件的乡镇卫生院收到传染病报告卡后马上实行网络直报。
2.    病例个案调查
县级疾控中心接到狂犬病例报告后,应及时对病例实行流行病学调查,调查内涵见《狂犬病病例个案调查表》(附表1)。
(二) 监视检测点监视检测
1.    监视检测点的选择原则
(1)在近五年疫情持续高发的省,选取高发县区作为国家级监视检测点;
(2)监视检测点具有一定的狂犬病防制工作基础,能够承担并完成监视检测使命;
(3)监视检测点的确定:在近年来疫情持续高发的广西、湖南、安徽、贵州4省,选择高发地市或县区作为国家监视检测点。
2.    监视检测内涵
(1)常规疫情监视检测
① 病例的发现与报告
同全国常规监视检测。
② 病例个案调查
监视检测点所在的县级疾控中心接到狂犬病病例报告后,应对所有病例实行个案调查,填写《狂犬病病例个案调查表》(附表1)。
(2)实验室监视检测
①标本采集、保存和送检:严刻按照《狂犬病标本采集技艺指南》(见附件1)请求,采集监视检测点报告的所有临床诊断病例的唾液、脑脊液、尿液、鼻咽洗液、皮肤组合或病死者脑组合等标本,送至省级疾控中心实行检测(送检表见附表2《狂犬病人标本送检登记表》)。
②标本检测:省级疾控中心承担本省监视检测点标本的实验室检测,采用RT-PCR方法检测狂犬病毒特异性核酸,采用免疫荧光法或酶联免疫吸附实验检测狂犬病毒抗原,对病毒抗原和核酸阳性的标本实行病毒核酸测序和剖析。详细操纵过程见《狂犬病实验室检测技艺指南》(附件2)。
③结果鉴定:各省疾控中心将核酸测序和剖析结果上报至国家疾控中心实行鉴定和剖析。
④实验室检测结果的汇总、反应:省疾控中心每季度末将本季度检测结果汇总并反应到各监视检测点,国家疾控中心接到标本后一个月之内将鉴定结果向各省反应。
(3)狂犬病暴露后预防处置情况监视检测
各监视检测点选择1所县区级疾控中心预防门诊、1所县及县以上综合医院和1所高发乡的卫生院实行狂犬病暴露后预防处置情况监视检测,由诊治大夫承担填写《狂犬病暴露人群门诊登记表》(附表4),收集前来就诊的所有狂犬病暴露者的预防处置相干信息。
(4)宿主动物监视检测
监视检测点所在地的疾控中心经过当地畜牧、兽医、公安等相干部门调查、了解所辖地区的犬等宿主动物情况,包括犬和其它有关动物的数量、种类和免疫覆盖等情况(调查表见附表5)。在或许情况下,对犬及其他宿主动物实行带毒情况调查。
五、数据收集、剖析、反应
(一)数据收集
1.狂犬病疫情法定报告信息
各级各类医疗机构、疾病预防控制机构和卫生检疫机构实行职务的医务人员按照《中华人民共和国传染病防治法》和《传染病疫情与突发公共卫生事件报告办理标准》的相干限定,对狂犬病病例实行报告。
2.狂犬病病例个案信息
县级疾控中心指定专人承担收集狂犬病病例个案信息,于每月10日以前将上月所有个案调查表录入狂犬病监视检测数据库,并上报省级疾控中心。省级疾控中心每月20日前将本省上月的狂犬病监视检测数据上报中国疾控中心。
3.狂犬病实验室监视检测信息
省级疾控中心承担收集、汇总辖区内狂犬病实验室检测结果,每季度末将本季度的结果录入狂犬病监视检测数据库,上报中国疾控中心。
4.狂犬病暴露者门诊汇总数据
监视检测点所在的县级疾控中心承担收集辖区内狂犬病门诊的《狂犬病暴露人群门诊登记表》(附表4),于每月10日前实行汇总并将汇回顾果录入狂犬病监视检测数据库,报告上级疾控中心。
5.狂犬病宿主动物根本情况调查数据
监视检测点所在的县级疾控中心承担收集辖区内狂犬病宿主动物的根本情况,每年1月15日将上年的《狂犬病宿主动物根本情况调查表》(附表5)的内涵录入狂犬病监视检测数据库,并将数据报告上级疾控中心,各省疾控中心承担收集省内所有狂犬病监视检测点的数据,并于每年2月15日前上报上年监视检测数据。
(二)数据质量控制
1.方法和准则的统一
(1)各项调查内涵均使用统一调查表和调查方法;
(2)使用指定的实验室检测方法和检测试剂实行标本检测。
2.数据库建立的质量控制
(1)使用统一的数据库录入数据;
(2)经过设计计算机App来识辨调查表逻辑错误,减少录入错误;
(3)经过人工抽查核对,发现非逻辑错误。
(三)资料剖析
各级疾控中心每季度、每年对狂犬病监视检测资料实行剖析,也可按照需要不按期地实行剖析。
1.病例的三间分布
从时间、地区、人群分布剖析狂犬病的发病死亡特点。
2.病例的暴露情况剖析
对致伤动物的种类、病例的伤口情况、预防处置情况等实行剖析。
3.暴露人群治疗处置情况剖析
对狂犬病暴露人群的特点,以及伤口处置、预防接种等情况实行剖析。
4.狂犬病宿主动物剖析
对监视检测点狂犬病宿主动物的数量、密度、免疫情况以及不同伤人动物的情况实行剖析。
5.狂犬病病原学检测结果剖析
剖析狂犬病病原学及其遗传变异情况。
6.流行因素剖析
综合监视检测结果及当地收集到的相干信息对狂犬病的流行因素实行综合剖析。(四)信息交流和反应
各级疾控中心应由专人承担监视检测工作,按期将有关监视检测报告、统计剖析和季度、年度回顾以E-Mail、传真或信函的形式报上级疾控部门和同级卫生行政部门。上级疾控部门接到报告后,应及时对剖析结果实行反应(以文件、信函、督导等方式)。
各监视检测点应按期将监视检测结果向邻近的地区及相干部门(如畜牧兽医部门)实行通报。
六、监视检测系统的组成和职责
(一)卫生行政部门
卫生部领导和组合协调全国狂犬病监视检测工作,各级卫生行政部门承担组合展开本辖区内狂犬病监视检测工作,并提供所需的监视检测经费,包管监视检测工作的顺遂展开。
(二)疾病预防控制机构
1.中国betway体育手机版
(1)组合监视检测方案的起草、论证和健全,为全国狂犬病监视检测提供技艺引导。
(2)组合对全国各省级疾控中心和国家级监视检测点专业技艺人员的训练。
(3)承担全国监视检测数据的收集、整理,按期对数据实行剖析、反应。
(4)承担狂犬病诊断试剂的准则化及各级网络实验室的质量控制。
(5)承担各省分离的狂犬病病毒的实验室鉴定工作。
(6)承担组合专家按期对全国狂犬病监视检测系统实行督导、评价。
(7)每年组合举行全国狂犬病监视检测年度工作回顾研讨会。
2.省级疾控中心
(1)按照全国监视检测方案,起草本省的监视检测实施方案,并组合实施。
(2)有用组合实施本省的常规监视检测工作。
(3)组合对市级疾控中心和国家级监视检测点的专业技艺人员的训练与引导。
(4)按期收集监视检测数据,并实行剖析、反应。
(5)按期对本省的监视检测工作实行督导与评价。
(6)每年对本省狂犬病监视检测工作实行年度回顾。
3.市级疾控中心
(1)有用组合实施本市的常规监视检测工作。
(2)引导本市国家级监视检测点的监视检测工作。
(3)按期收集监视检测数据,并实行剖析、反应。
(4)按期对本市的监视检测工作实行督导、质量控制与评价。
(5)每年对本市狂犬病监视检测系统实行年度工作回顾。
4.县级疾控中心
(1)按照全国监视检测方案和省级的监视检测实施方案的请求,遂项贯彻各项监视检测工作。
(2)接受上级疾控中心技艺的训练与引导,标准各项监视检测工作。
(3)安排专人按期收集、整理、汇总和上报监视检测数据。
(4)按期对监视检测工作实行质量控制与评价。
(5)每年对本地狂犬病监视检测工作实行年度工作回顾。
(三)医疗机构
各级各类医疗机构承担狂犬病病例的发现及报告工作,协助县、区级betway体育手机版实行流行病学调查及标本采集工作。对医护人员进职业务训练,尤其是传染病防治法及相干常识的训练。
七、保障工作
(一)组合保障
1.狂犬病监视检测应纳入当地疾控中心日常工作。
2.各级疾控中心应明确一名业务领导承担监视检测工作。
3.承担监视检测使命的各级疾控中心应指定仔肩心强、业务能力强的专业技艺人员具体实施监视检测工作。
4.参与监视检测工作的各单位应增强相干业务人员的训练。
(二)经费保障
1.为保障监视检测工作的顺遂实行,国家为监视检测点提供一定的监视检测发动经费。
2.监视检测点所在的省、市、县应提供监视检测配套经费。
3.监视检测经费必须实行专款专用。
(三)物资保障
承担监视检测使命的各级疾控中心和医疗机构应包管监视检测所需的各种物资和技艺支撑。由中国疾控中心统一提供监视检测点检测试剂。
(四)质量控制
1.每年组合监视检测工作的质量评价。
2.每年按照监视检测点疫情变化,对监视检测点和监视检测工作筹划实行必要的调整。
八、附件
附表1  狂犬病病例个案调查表
附表2  狂犬病人标本送检登记表
附表3  狂犬病病原学检测结果表
附表4  狂犬病暴露人群门诊登记表
附表5  狂犬病宿主动物根本情况调查表
附件1  狂犬病标本采集技艺指南
附件2  狂犬病实验室检测技艺指南
附表1                  狂犬病病例个案调查表
县(市)名称:              国标码:□□□□□□     病例编号:□□□□□
1、一般情况
1.1姓名:                    1.2性别:□1男  □2女           1.3年龄:     
1.4职业:□1农民   □2工人   □3学生   □4散童   □5其它          
1.5详细住址:            省(自治区、直辖市)           市(地区)           县(区)
           乡(镇、街道)            村(居委会)          组(门牌号)
2、暴露(被伤)及伤口处置情况
2.1暴露(被伤)日期:                   
2.2暴露详细地址:           省(自治区、直辖市)          市(地区)        县(区)
           乡(镇、街道)            村(居委会)          组(门牌号)
2.3暴露方式: □1咬伤  □2抓伤  □3其它      
2.4暴露程度:□1 Ⅰ度 □2 Ⅱ度  □3 Ⅲ度
2.5暴露部位(可多选):□1头面     □2颈部     □3躯干     □4手臂
□5手部     □6下肢膝以上     □7下肢膝以下
2.6伤口处置:□1未处置(转至3)    □2自行处置    □3医疗机构处置
2.6.1处置时间:                   
2.6.2处置单位:□1村卫生室  □2乡镇卫生院  □3县级及以上医疗机构  □4其他    
2.6.3处置方式(可多选):
□1挤压出血   □2冲洗   □3消毒   □4伤口缝合   □5其他     
3、预防注射
3.1暴露免疫史:□1有(免疫时间          日, 免疫针次     针),□2无
3.2暴露后抗血清注射:□1有,□2无(转至3.3)
3.2.1种类:□1免疫球蛋白  □2抗血清
3.2.2注射时间:            
3.2.3注射剂量:     
3.2.4有无过敏:□1有(过敏表现:                 )  □2无
3.3.暴露后人用狂犬病疫苗注射:□1有,□2无(转至4)
3.3.1注射单位:□1村卫生室   □2乡镇卫生院  □3县级及以上医疗机构  □4其他    
3.3.2 种类:□1 Vero   □2地鼠肾
3.3.3首针时间:                   时,首针剂量:□1剂  □2剂
3.3.4免疫程序:□1 0-3-7-14-28    □2其他            
3.3.5疫苗注射       针次,如未全程,原因:                     
3.3.6是否增强注射:□1是(增强针次:    针), □2否
3.3.7疫苗生产单位:              ,批号:           ,失效期:             
4、临床资料
4.1发病时间:              日              4.2 死亡时间:             
4.3诊断单位:□1村卫生室   □2乡镇卫生院  □3县级及以上医疗机构  □4其他      
4.4发病临床症状(可多选):□1烦躁  □2恐水  □3怕风  □4畏光  □5抽搐  □6认识失常
5、实验室检测
5.1采样时间:              日             
5.2标本种类:□1唾液  □2脑脊液 □3尿液  □4鼻咽洗液
5.3检测名目:□1病原检测   □2核酸检测 
5.4检测结果:□1阳性   □2阴性
6、伤人动物情况
6.1动物种类:□1狗  □2猫  □3其它       
6.2伤人动物来源:□1自家养  □2邻居养  □3流浪动物  □4野生动物  □5其它       
6.3若为家养动物,是否接种兽用狂犬病疫苗:□1是(接种日期:             日),□2否
6.4动物伤人原因:□1主动袭击  □2自卫伤人  □3嘻逗  □4其他     
6.5.是否同时咬伤多人:□1是,□2否
6.6伤人后:□1如常(转至7)  □2打死  □3失踪  □4病死  □5宰杀  □6其他      
6.6.1死亡时间:             
6.6.2动物死后处置方式:
□1焚烧  □2深埋  □3出售   □4丢弃 □5屠宰剥皮  □6烹食  □7其‘它    
7、如为一犬伤多人
7.1共伤    人           7.2本例为第    例次           7.3共死亡_____人
被调查人与患者关系:                           调查人签名:               
调查人单位:                                   调查日期:           
填表说明
1.        在所选项此刻的“□”中,划“∨”作为选择答案,若无特殊说明,所有选项均为单选。凡有“      ”的选项,须填写相符合内涵;
2.        病例编号填写限定:年号(两位数)、流水号(后边三位)
3.        “2.4暴露程度”参照WHO创议分类准则分为以下三类:
Ⅰ度:被犬舔过无开放性伤口的健康皮肤和粘膜;
Ⅱ度:裸露的皮肤或粘膜被轻轻咬过,表面划伤,但没有破口;
Ⅲ度:任何部位的皮肤或粘膜,一处或多处被咬破或抓穿。
附表2                  狂犬病人标本送检登记表
编号
患者姓名
性别
年龄
职 业
住   址
临床诊断
发病日期
采样日期
标本种类
检验名目
备注
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
送检单位:_______________________    采样人:______________
送检人: ______________            送检日期:_________年_____月_____日
附表4                                       狂犬病暴露人群门诊登记表
                  县(市、区、旗)                乡(镇)             填表日期:     年   月   日   填表人签字:         页:
(岁)
暴露部
位及分级
伤口
自行
处置
门诊
伤口
处置
抗血
疫苗种类、
批号、厂家
接种日期
伤人动物
备注
D0
D3
D7
D14
D28
增强
名称
类别
免疫史
转归
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
填表说明: 1暴露分级分为三类:Ⅰ度:被犬舔过无开放性伤口的健康皮肤和粘膜;Ⅱ度:裸露的皮肤或粘膜被轻轻咬过,表面划伤,但没有破口;
Ⅲ度:任何部位的皮肤或粘膜,一处或多处被咬破或抓穿。
2.伤人动物种类:可分为疯动物、可疑疯动物、正常动物(家养、无主动物、野生动物)、不知道等
附表5               狂犬病宿主动物根本情况调查表
      省(自治区、直辖市)        市(地区)        县(区)     
乡镇(办事处)
人口数
动物数量(只)
兽用疫苗数(份)
其它
其它
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
合计
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
填表人:                             填表日期:          
附件1                   狂犬病标本采集技艺指南
1、 采集标本者个人安全防备
(1)从事标本采集和运送的工作人员均要经过专门训练方可实行此项工作。
(2)从事标本采集和运送的工作人员均要实行暴露前免疫。
(3)采集标本前要穿戴好防备服装、眼镜、手套,作好技艺上的准备。
2、采集标本的包装:请求使用符合生物安全准则的包装盒盛放标本。
3、采集标本的时间、类型和存放
(1)在狂犬病病人入院后,尽或许早期采集标本。
(2)用于病原学检测的标本:病人唾液、脑脊液、尿液、鼻咽洗液、咬伤处皮肤组合或病人死后的眼角膜、脑组合等均可用于病毒的检测和分离。以脑组合阳性率最高。
(3)用于抗体检测的标本:无菌采集病例或免疫后血液2~3 ml,分离血清后用于狂犬病特异性抗体的检测。
(4)标本的存放
a)       用于病毒检测和分离的标本在-20℃或-20℃以下低温(-70℃)、液氮、或放在含50%甘油的PBS中以保持标本的感染性,应将标本盛于无菌容器内,放在密封的盒内并注明其危险性以防病毒的扩散。
b)       标本请求无菌采集,-20℃保存待检。
4、采集标本的运送
用于病毒检测和分离的标本,应带冰、干冰或液氮条件下尽快运送至实验室。
5、采集标本的保存
承担标本接收和检测的实验室,接到标本以后若暂时不检测,应马上冷冻保存。用于病毒检测和分离的标本可以在-70℃长期保存,没有条件的也可以在-20℃条件下短期保存。
6、标本的检测和结果反应程序
病例调查及标本    县CDC实验室:标本处置,病例调查     省级CDC实验室:检测     国家CDC:疑难病例、分离毒株。
附件2                狂犬病实验室检测技艺指南
1、实验室条件及生物安全操纵请求
(1) 从事狂犬病临床和实验室的工作人员需要暴露前免疫,所有意外暴露于狂犬病毒时必需马上报告本部门承担人。
(2) 操纵所有潜在狂犬病感染的材料均应在P2或P3(实验室固定毒在P2,病人或动物分离的街毒在P3)生物安全实验室内实行。
(3) 当实验室对接收到的动物标本实行操纵时,必须在P3以上条件的专业实验室中实行。没有安全实验室(P3级)的单位,严禁从事病毒分离工作。
(4) 实验前要穿戴好防备服装、眼镜、手套,作好技艺上的准备。
(5) 由于空气传播狂犬病毒已经得到证实,因此高速混悬或离心操纵应在密闭状态下实行。
(6) 实验后要作好善后消毒处置,狂犬病毒对脂溶剂(肥皂水、醚、氯仿、丙酮),45~70%乙醇,碘制剂和四铵化合物敏感,操纵完成对操纵台、实验材料等要用相符合的消毒剂或高压蒸汽实行消毒处置。
2、实验室检测网络组成及职责
(1)       中国betway体育手机版牵头,全国各省级betway体育手机版及所辖区域内的各级betway体育手机版组成实验室检测网络。
(2)       中国betway体育手机版职责
A.     诊断试剂的研制、准则化,并推荐质量稳固可靠的诊断试剂;
B.     承担毒株的鉴定和病毒变异性调查;
C.     对各级实验室检测人员实行技艺训练。
D.     协助省级betway体育手机版完成标本的实验室检测。
(3)       省级betway体育手机版职责
A.     收集、保存辖区内各监视检测点的各种待检测标本。
B.     辖区内各种标本的实验室检测。
C.     对本省监视检测点标本采集和运送给与技艺引导和协助。
(4)       县级监视检测点betway体育手机版职责
采集病例标本,运送病例标本至省级betway体育手机版。
3、实验室检测方法
(1)病原检测:
A.    免疫荧光法检测抗原:病人的脑脊髓液或唾液直接涂片、病人的角膜印片或咬伤部位皮肤组合或脑组合印片或冷冻切片,丙酮固定,抗狂犬病毒特异性荧光抗体染色检测狂犬病毒抗原。
B.    快速狂犬病酶联免疫吸附法检测抗原:用pH 9.6的碳酸盐缓冲液稀释的抗狂犬病毒核衣壳IgG包被96孔酶标板,4℃过夜;用含0.3%牛血清白蛋白和5% 蔗糖的pH9.6碳酸盐缓冲液封闭30分钟;将采集到的标本研磨,用pH 7.4 PBS制成30%的悬液,离心取上清加入酶标板孔内,同时设阴性、阳性对照,200 µ l/孔,37℃孵育1小时;洗板四次后加入纯化的酶标记抗狂犬病毒抗体200μl/孔,37℃ l小时后洗板,加入酶反应底物,室温作用30分钟,2M H2SO4终止反应,肉眼观察或酶标仪测定结果。
(2)核酸检测:
RT-PCR方法:以特异性扩增核蛋白(N)基因最保守区域为目的基因,设计一对引物:N1(+):5’-587TTT GAG ACT GCT CCT TTT G605-3’; N2(-):5’-1092CC CAT ATA GCA TCC TAC605-3。唾液、脑脊液、皮肤或脑组合标本以及感染病毒后的细胞培养物或鼠脑均可用于病毒核酸的检测。根本步骤为:待检标本用细胞总RNA分离试剂提取病毒RNA,再经过逆转录反应合成与目的基因RNA序列互补的cDNA,PCR循环特异性扩增目的基因cDNA,电泳检测PCR扩增产物,判断检测结果。
(3)病毒分离:抗原或核酸检测阳性标本可以实行病毒分离以便实行更深刻的科研。
A.    细胞培养法分离病毒:将唾液、脑脊液、皮肤或脑组合标本研磨后,用PBS或MEM制成30%悬液→4℃ 2000r/min离心20分钟→取上清接种在96孔或24孔培养板内已形成单层的敏感细胞(鼠神经传代细胞、Vero细胞或BHK21 细胞)上,吸附2小时后补加含2%血清的维持液,37℃ 5%C02 孵育约4~5天,丙酮固定感染后的细胞,用抗狂犬病毒单克隆抗体观察特异性荧光包涵体判断结果。阳性时汲取上清至一无菌容器内-70℃保存备用或继续传代。病毒经过细胞的多次传代可以适应细胞培养并得到扩增。
B.    乳小白鼠接种法分离病毒:30%的病人或动物脑组合悬液,离心取上清,接种1~2日龄乳鼠脑内,每个样品注射一窝乳鼠;注射后的乳鼠应在具有高效滤过装置的负压饲养柜内饲养。症状不典型时可于接种第一代后取脑继续传代,连续传代后暗藏期逐渐规律,一般为5天左右。发病乳鼠若确定为狂犬病毒感染,无菌取脑,-70℃或用含50%甘油的PBS -20℃保存,也可研磨后加灭菌脱脂牛奶制成20%悬液,真空冷冻干燥,长期保存。未发病存活的鼠保存至21天后杀死作免疫荧光检测
(4)抗体检测
A.    特异性抗体检测:在自然感染情况下,狂犬病毒通常由被疯动物咬伤时经过其带有病毒的唾液加入机体伤口内,在入侵部位狂犬病毒根本上不增殖,一般也不侵入血流,故不能形成病毒血症。因此,在感染后的一段时间内狂犬病毒或其抗原不能与机体免疫系统广泛接触,不能有用刺激机体产生抗狂犬病毒感染的免疫应答反应。狂犬病的晚期因血脑屏障作用被破坏,脑内大量病毒抗原得以加入血流,可以刺激机体的免疫系统产生大量特异性抗体。因此,许多狂犬病人在发病早期血清中查不到抗体或抗体滴度很低,狂犬病特异性抗体只在临床疾病的晚期出现。
B.    中和抗体检测:狂犬病疫苗免疫后血清中和抗体水平是测定疫苗免疫力程度的评判指标,WHO狂犬病专家委员会认为中和抗体水平等于或高于0.5IU/ml血清,暗示能得到有用的保护。狂犬病毒中和抗体的检测可以用传统的小鼠中和试验或WHO推荐的快速荧光灶抑制试验(RFFIT)。RFFIT试验时倍比稀释已经灭活的血清样品,同时设阴、阳性血清对照。病毒用准则固定毒CVS株,细胞用BHK21细胞系。首先将稀释的被检及对照血清0.1ml加入96孔细胞培养板中,再在各血清孔中加入0.1 m1准则病毒稀释液(100TCID50),37℃中和1.5小时;然后每孔加入细胞,37℃、5% C02培养过夜后弃掉培养液,PBS洗一次,丙酮固定。干燥后,加荧光素标记的抗狂犬病毒抗体,37℃ 30分钟,PBS洗3次,荧光显微镜观察结果:比较实验组和阴性血清组的荧光灶,实验组中能使荧光灶抑制≥50%的血清最高稀释倍数,即为被检血清的中和抗体滴度。
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